应用笔记：24分钟内可再现的多重扩增数据

多重实时PCR（qPCR）是一项强大的技术，可帮助您节省时间，节省有限的样品并降低基因分析的成本。尽管多重qPCR分析有许多好处，但通常需要进行广泛的优化，因为每次分析引物组的数量增加会损害扩增效率。分子诊断学的进步要求更短的测定时间，这进一步挑战了可复制和准确的快速多重qPCR结果的产生。我们通过结合CleanAmp™dNTP和灵敏的qPCR仪器展示了三重qPCR。

CleanAmp™dNTP提供了一种在PCR中激活热启动的通用方法。在PCR中用CleanAmp™dNTP轻松替换为标准dNTP，具有与更昂贵的热启动酶相同的优势。CleanAmp™dNTP通过阻止核苷酸掺入直至dNTP热激活，在PCR热循环开始时提供了精确的控制（1）。DNA聚合酶延伸的温度依赖性控制极大地减少了错误引发，引物二聚体形成和其他通常发生的有害影响，从而在多重（2）和快速PCR期间产生了最佳性能。试剂盒中提供CleanAmp™dNTP，其中包括经过验证可成功进行测定的DNA聚合酶。CleanAmp™PCR Kit可以灵活地用于多种测定形式，包括快速循环和多重PCR。

Eppendorf realplex 4 S实时PCR系统具有超快的，由珀尔帖（Peltier）控制的热块，其以6°C /秒的速度加热并以4°C /秒的速度冷却，从而可以完成标准的40循环qPCR反应不到一小时 珀尔帖（Peltier）装置还可以确保精确的温度控制以及较高的模块均质性，这对于高质量PCR反应至关重要。光学模块包括96个LED阵列，这些LED被预先选择和均衡，以使它们均匀激发所有阱。这种设置消除了作为参考染料ROX的要求，从而使得可使用作为的Taqman ®染料。这是许多常规qPCR仪器所必需的。Realplex 4 S还利用光电倍增管（PMT）进行信号检测，这是目前可用的最灵敏，最经济的检测技术。

为了进一步探索CleanAmp™PCR试剂盒和Eppendorf realplex 4 S实时PCR系统的优势，本文的研究以这两种技术的结合为特色，以实现可重现的实时三重PCR检测，可在不到30分钟的时间内完成30分钟。

方法

所述CleanAmp™的dNTP试剂盒用于进行实时三重检测在realplex实时4的快速循环与水解探针检测仪。进行了两个实验，使用CleanAmp™PCR试剂盒扩增了三个小鼠基因组DNA靶标，分别为125、185和214个碱基对。首先，使用标准和快速热循环条件对所有三个靶标同时进行三重扩增（图1）。其次，使用快速方案将三个靶标同时扩增和扩增（图2）。所有反应均通过带有水解探针检测的带有Masterclear™盖条的Eppendorf实时PCR管条进行：125 bp（6-JOE; 0.2 µM），185 bp（FAM; 0.05 µM）和214 bp（ROX; 0.2 µM） ）。

图1.在标准和快速热循环条件下一致的三链扩增。显示的数据是小鼠基因组DNA的5倍稀释系列稀释液，一式四份进行：（A）扩增图，（B）标准曲线和（C）数据汇编表。

评估了适用于标准循环和快速循环的方案的三重qPCR检测。所有反应均一式四份设置，并使用一系列小鼠基因组DNA的5倍系列稀释液，范围从320 pg至1.0 µg。标准热循环qPCR实验的方案遵循CleanAmp™PCR试剂盒产品说明书中的“多重PCR方案” （1X PCR缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和2.5 mM MgCl 2），0.4 mM CleanAmp™dNTP，0.01 U / µL Taq DNA聚合酶和0.2 µM引物（25 µL）。在快速循环PCR多路复用协议遵循上述“复用PCR方案”具有以下改变：70毫米氯化钾，4.0毫摩尔MgCl 2，0.6 mM的CleanAmp™的dNTP，0.33 U /μLù 的Taq DNA聚合酶，引物（125 bp和185 bp组为0.5 µM，214 bp引物组为0.7 µM）。

：在快速热循环条件下单重和三重扩增方案的比较。显示的数据是小鼠基因组DNA的4倍稀释系列，一式四份进行：（A）覆盖具有相应标准曲线的单重和三重扩增图，以及（B）数据汇编表。

然后在快速循环条件下进一步评估CleanAmp™dNTP试剂盒，以单重和多重反应形式扩增相同的三个靶标。该测定一式三份，用于扩增小鼠基因组DNA的5倍系列稀释液，范围从320 pg至200 ng。遵循如上所述的快速循环多路协议和热循环条件。对于单重反应，遵循CleanAmp™PCR Kit产品说明书中的“快速热循环方案” （1x PCR缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和4.0 mM MgCl 2），0.4 mM CleanAmp ™dNTPs，0.33 U / µL Taq DNA聚合酶和0.5 µM引物（15 µL）。